Forschung und Referenzen

GcMAF (vom Gc Protein abgeleiteter Makrophagen-Aktivierungsfaktor)

Für die Behandlung von Krebs, HIV und Immunkrankheiten

Forschung und Referenzen

Versuchsbericht

14-JUN-2012 Stabilität von GcMAF im Serum (PDF)

H Mukai, Y Uto. Abteilung für Biologische Wissenschaft und Technologie, Universität Tokushima.

  • Dieses Experiment wurde an der Universität Tokushima in Japan durchgeführt, um die kurz-, wie langfristige Lagerfähigkeit und Stabilität der phagozytischen Makrophagenaktivität unseres GcMAFs der 2. Generation zu demonstrieren.  Die Ergebnisse zeigen, dass die 2. Generation GcMAF im Serum für 1 Jahr bei 4ºC, für 14 Tage bei Raumtemperatur (etwa 20ºC) und für 7 Tage bei 40ºC stabil bleibt.
  • Bitte beachten Sie, dass diese Forschung und die damit zusammenhängenden Ergebnisse nur für das GcMAF der zweiten Generation gilt, das nach unserem patentierten Produktionsprozess hergestellt wird. Konventionelles GcMAF, das unter Verwendung der Vitamin-D-Affinitätschromatographie hergestellt wird, besitzt nicht die gleiche Stabilität wie das GcMAF der zweiten Generation, da es eine höhere Oxidationsneigung besitzt. Der Unterschied in der Stabilität ist in den unterschiedlichen Produktionsprozessen begründet und nicht aufgrund des GcMAF selbst.

Phagozytische Makrophagenaktivitäts-Test der zweiten Generation von GcMAF

GcMAF der zweiten Generation wird auf die phagozytische Aktivität der Makrophagen unter Verwendung von Mausmakrophagen und roten Blutkörperchen von Schafen an der Universität Tokushima getestet. Die roten Blutkörperchen werden opsonisiert und damit für die aktivierten Makrophagen zur Ingestion und Zerstörung markiert. Die opsonisierten Blutkörperchen können als lila Bereiche in den klaren Zellen beobachtet werden. Anhand dieser Beobachtung berechnen wir den Phagozytose- (Ingestion) Index (PI).

Die lila markierten Makrophagen wurde durch GcMAF aktiviert und nehmen nun die opsonisierten roten Blutkörperchen auf (hier in weißer Farbe markiert).

Vorläufige Ergebnisse von in vivo-Experimenten an Krebs tragenden Mäusen

In vivo Experimente von Krebs-tragenden Mäusen wurden mit GcMAF der zweiten Generation, und gereinigtem GcMAF hergestellt nach der Methode von Dr. Yamamoto unter Verwendung einer Kochsalzlösung, durchgeführt. Die 2. Generation stellte sich in diesen Experimenten als deutlich effektiver als gereinigtes GcMAF heraus. (Unveröffentlichte Ergebnisse, Universität Tokushima).

Veröffentlichte Forschungsarbeiten zu GcMAF 

Zusammen mit GcMAF Forschern der Universität Tokushima in Japan wiird an der weiteren Entwicklung der zweiten Generation GcMAF gearbeitet. Im Folgenden finden Sie Forschungsberichte zu GcMAF, die innerhalb der letzten 10 Jahre von der Universität Tokushima publiziert und in wissenschaftlichen Fachzeitschriften verlegt worden sind. Die Forschung bezüglich GcMAF schreitet fort und wird auch in Zukunft zu weiteren Veröffentlichungen führen.

2010 Vitamin D-bindender Protein-Makrophagen-Aktivierungsfaktor hemmt HCC bei SCID-Mäusen 

K Nakayama, N Matsuura, T Kanematsu, H. Fujioka, H. Nakayama, N Matsuura, Kanematsu, H. Fujioka.

  • Hintergrund. Eine wahrscheinliche Wiedererkrankung an hepatozellulären Karzinomen stellt das größte Problem nach der Behandlung dieser dar. Daher ist eine neue Strategie für die Behandlung der Krankheit erforderlich. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, zu untersuchen, ob der Vitamin-D-bindende Protein-Makrophagen-Aktivierungsfaktor (DBPmaf) das Wachstum von HCC hemmen kann.
  • Schlussfolgerung. DBP-maf weist mindestens zwei neue Funktionen auf, nämlich die der antiangiogenen Aktivität und Tumorzerstörung durch die Aktivierung von Makrophagen. DBP-maf stellt daher eine potenzielle neue Strategie zur Behandlung von HCC dar.

Abbildung 2 repräsentative Tumore, die 21 Tage nach dem Beginn der Verabreichung von DBP-maf entnommen wurden. (Dosis: 40 ng/kg/Tag)

 

Abbildung 3 Veränderungen beim Volumen der Tumore (n=10) 21 Tage nach Beginn der Behandlung. Die Tumore wuchsen ungehemmt bei der Kontrollgruppe, wohingegen das Tumorwachstum der Testgruppe signifikant eingeschränkt wurde.

 

Abbildung 4 Anzahl der Mikrogefäße innerhalb der transplantierten HepG2 Tumore. Die Anzahl dieser Mikrogefäße bei den Tumoren von behandelten Mäusen war signifikant geringer als die von unbehandelten Tumoren.

 

Kommentar des Autors:

Hepatozelluläre Karzinome (HCC) zählen zu den häufigsten Malignomen weltweit. Die therapeutischen Möglichkeiten zur Behandlung von HCC sind begrenzt und häufig breiten sich, selbst nach kurativen Behandlungen, Wiedererkrankungen aus. Solide Tumore, einschließlich HCC, müssen dabei ein adäquates Gefäßnetz entwickeln, um sich selbst mit Nahrung zu versorgen. Die Tumorangiogenese stellt damit eine der Grundvoraussetzungen für Tumorwachstum und Proliferation dar.

Wir berichteten zuvor, dass der vom Vitamin D-Bindungsprotein (DBP) abgeleitete Makrophagenaktivierungsfaktor ein Hemmstoff für die Angiogenese ist. Dieser wird auf natürlicher Basis in der humane Bachspeicheldrüsenkrebszelllinie ByPC-3 gefunden.

Die vorliegende in vivo-Studie verdeutlicht, dass DBPmaf die Tumorprogression von xenografierten HCC-Zellen bei SCID-Mäusen reduzieren kann. Die in vitro-Studie zeigt zudem, dass DBP-maf mindestens zwei biologische Funktionen aufweist; darunter eine antiangiogene Aktivität und die Verstärkung der Makrophagenaktivierung.

Die Anti-Angiogenese gilt als eine der wirksamsten Methoden, um eine Tumorregression oder zumindest einen Wachstumsstillstand hervorzurufen. Weitere berichten bestärken die Annahme, dass DBP-maf anti-angiogen wirkt und das Wachstum von HCC bei Mäusen behindert.

Berichten nach, erhöhen hepatozelluläre Karzinome MVD, sowie den VEGF-Spiegel im Serum oder Tumorgewebe. Bevacizumab (Avastin, ein humanisierter, Anti-VEGF-monoklonaler Antikörper von Mäusen) wird klinisch zur Behandlung von Darmkrebs eingesetzt. Mehrere Studien untersuchten die Verwendung von Bevacizumab als einziges Behandlungsmittel oder in Kombination mit zytotoxischen oder molekular ausgerichteten Wirkstoffen bei Patienten mit fortgeschrittenem HCC. Es wurde gezeigt, dass DBP-maf seine antiangiogene Wirkung in ähnlicher Weise wie Bevacizumab durch die Hemmung der VEGF-Signalkaskade entfaltet. Alle diese Ergebnisse zeigen, dass DBP-maf ein vielversprechender Angiogenese-Hemmstoff ist, wobei weitere Erforschung der Wirkungsweise erforderlich ist.

Unsere vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass DBP-maf ein massives Eindringen von Makrophagen in die transplantierten HCC-Zellen induziert und darüber hinaus Makrophagen als Antigenpräsentationszellen gegen Tumorantigene aktiviert. Diese Makrophagen wirken damit nicht nur als angeborene Immunzellen, sondern funktionieren auch als dendritische Zellen.

Dadurch, dass wir keine antiproliferative Wirkung des DBP-maf auf HCC-Zellen beobachten konnten, deutet dies darauf hin, dass DBP-maf hauptsächlich durch die Hemmung der Angiogenese und das Töten von Tumorzellen durch aktivierte Makrophagen funktioniert.

Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass die Behandlung von SCID-Mäusen mit subkutanem HepG2 durch DBP-maf zur Tumorwachstumsunterdrückung führt.

2005 Gc Protein (Vitamin D-bindendes Protein): Gc Genotypisierung und GcMAF Grundstoffaktivität 

H Nagasawa, Y Uto, H Sasaki, N Okamura, ein Murakami, S Kubo, KL Kirk, H Hori.

Zusammenfassung. Das Gc-Protein (human group-specific component (Gc), ein Vitamin-D-bindendes Protein oder Gc-Globulin) weist wichtige physiologische Funktionen auf, darunter die Beteiligung am Vitamin D-Transport und dessen -Aufbewahrung, die Reinigung von extrazellulärem G-Aktin, die Verstärkung der chemotaktischen Aktivität von C5a für Neutrophile bei Entzündungen und die Makrophagenaktivierung (vermittelt durch ein GalNAc-modifiziertes Gc-Protein (GcMAF). In dieser Übersicht wird die Struktur und Funktion des Gc-Proteins vor allem im Hinblick auf die Gc-Genotypisierung und die GcMAF-Grundstoffaktivität untersucht. Eine Diskussion über die Forschungsstrategie “GcMAF als Ziel für die Wirkstoffforschung” ist auf der Grundlage unserer eigenen Forschung enthalten.

2004 Assoziation der Makrophagenaktivierungsfaktor (MAF) Grundstoffaktivität mit Polymorphismus im Vitamin D-bindenden Protein (PDF)

H Nagasawa, S Saki, Y Uto, S Kubo, H Hori.

Zusammenfassung. Hintergrund. Serum Vitamin D-bindendes Protein (Gc-Protein oder DBP) ist ein stark exprimiertes polymorphes Protein, das durch eine Kaskade von Kohlenhydratverarbeitungsreaktionen der Vorläufer des entzündungs-präparierenden Makrophagenaktivierungsfaktors (GcMAF) ist. Um die Beziehung zwischen Gc Polymorphismus und GcMAF Grundstoff-Aktivität aufzuklären, schätzten wir die phagozytische Fähigkeit von drei Homotypen des Gc-Proteins, Gc1f-1F, Gc1s-1S und Gc2-2 durch Verarbeitung ihrer Kohlenhydratanteile ab.

Verfahren. Wir führten die Gc-Typisierung von humanen Serumproben durch isoelektrische Fokussierung (IEF) durch. Das Gc-Protein aus menschlichem Serum wurde mit einer Affinitätschromatographie mit 25-Hydroxyvitamin-D3-sepharose gereinigt. Ein Phagozytose-Assay von Gc-Proteinen, modifiziert unter Verwendung von beta-Glycosidase und Sialidase, wurde durchgeführt.

Ergebnisse. Durch die Analyse der GcMAF-Grundstoffaktivität unter Verwendung von beta1-4-bindungsspezifischer Galactosidase aus Bohnen wurde gezeigt, dass der Gc1F-1F-Phänotyp die Galbeta1-4GalNAc-Bindung enthält.  Die GcMAF-Grundstoffaktivität des Gc1F-1F-Phänotyps war unter den drei Gc-Homotypen am höchsten.

Schlussfolgerung. Der Gc-Polymorphismus und die Kohlenhydratvielfalt des Gc-Proteins sind für die pleiotropen Effekte signifikant.

2003 Charakterisierung des humanen vom Gc-Protein-abgeleiteten Makrophagen-Aktivierungsfaktors (GcMAF) und seiner funktionellen Rolle in der tumorösen Makrophagenaktivität (PDF)

S Mohamad, H Hori, H Nagasawa, K Usui, Y Uto.

Einführung. Makrophagen sind essentiell für die körpereigene Immunabwehr und spielen eine wichtige Rolle bei der Immunantwort gegen Bedrohungssignale. Makrophagen sind zudem dafür bekannt, dass sie eine kritische Rolle bei der Antitumor-Immunität haben, den Tumor infiltrieren können und demnach bei den meisten Tumorstellen gefunden werden können. Inzwischen gilt das Gc-Serumprotein (auch als Vitamin D3-bindendes Protein bekannt) aufgrund der multifunktionellen Eigenschaften als Vorläufer für den Makrophagen-Aktivierungsfaktor. Das Gc-Protein kann durch eine induzierbare B-Galactosidase von B-Zellen und Neuraminidase von T-Zellen zu einem potenten Makrophagenaktivierungsfaktor (GcMAF), einem Protein mit N-Acetylgalactosamin (GalNAc) als Restzuckerkomponente, umgewandelt werden.

Aktivierte Makrophagen exprimieren eine Tumoraktivität durch Aufnahme von Tumorzellen, die Freisetzung einer reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktiven Stickstoffspezies (RNS) oder beidem. Wir berichteten, dass in situ-Modifikation von Gc-Protein mit B-Galactosidase und Neuraminidase die Freisetzung von Superoxid im Thioglykolat von Peritonealmakrophagen von Mäusen erhöht. Yamamoto et al. zeigten die Möglichkeit der Verwendung von GcMAF als Immunmodulator für die Krebsbehandlung. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit eines Assays für GcMAF. Kanan et al. berichteten über die quantitative Analyse von GcMAF aus Humanserum. Der Zuckeranteil von GcMAF wurde jedoch nie qualitativ untersucht. An dieser Stelle präsentieren wir die Studie bezüglich der qualitativen Analyse von GcMAF aus gereinigtem Humanserum sowie dessen Einfluss auf die Makrophagenaktivität.

2003 Vom Gc Protein-abgeleiteter Makrophagen-Aktivierungs-Faktor (GcMAF): Isoelektrisches Fokussierungsmuster und tumoröse Aktivität (PDF)

S Mohamad, H Nagasawa, S Saki, Y Uto, Y Nakagawa, K Kawashima, H Hori.

Hintergrund. Gc-Protein ist der Vorläufer des Gc-Protein-abgeleiteten Makrophagen-Aktivierungsfaktors (GcMAF) mit den drei Phänotypen: Gc1f, Gc1s und Gc2, basierend auf der vorliegenden elektrophoretischen Mobilität. Der Unterschied in der elekrophoretischen Mobilität begründet sich in der unterschiedlichen posttranslatorischen Zusammensetzung der Zuckereinheit.

Materialen und Methoden. Wir verglichen den Unterschied der elektrophoretischen Mobilität zwischen dem Gc-Protein und GcMAF anhand der isoelektrischen Fokussierungs (IEF)-Methode. Die tumoröse Aktivität von mit GcMAF behandelten Makrophagen wurde nach der Kokultur mit L-929-Zellen bewertet. Der tumoröse Mechanismus wurde mit dem TNF-Bioassay und Stickoxid (NO) Release untersucht.

Ergebnisse. Ein Unterschied in der elektrophoretischen Mobilität des Gc-Proteins und GcMAFs konnte nachgewiesen werden. Obwohl die tumoröse Aktivität der GcMAF-behandelten Makrophagen nachgewiesen wurde, konnte keine Freisetzung von TNF und NO gezeigt werden.

Schlussfolgerung. Der Unterschied der isoelektrischen fokussierenden Mobilität beim Gc-Protein und GcMAF könnte nützlich sein, um ein GcMAF-Nachweisverfahren zu entwickeln. GcMAF erhöhte die Makrophagen-Tumor-Aktivität. Allerdings waren die TNF und NO-Freisetzung nicht an dem Mechanismus beteiligt.

2002 Tumorzellen alpha-N-Acetylgalactosaminidase-Aktivität und ihre Beteiligung an der GcMAF-assoziierten Makrophagenaktivierung (PDF)

S Mohamad, H Nagasawa, Y Uto, H Hori.

Zusammenfassung. Die Anreicherung von Alpha-N-acetyl galactosaminidase (alpha-Nagalase) im Serum von Krebspatienten und die Deglycosylierung des Gc-Protein, das eine Vorstufe der GcMAF-ausgelösten Makrophagenaktivierungskaskade ist, die schließlich zur Immunsuppression bei fortgeschrittenen Krebspatienten führt, konnte gezeigt werden.

Wir untersuchten die biochemische Charakterisierung von alpha-NaGalase aus mehreren humanen Tumorzelllinien. Zudem untersuchten wir die Wirkung auf die Wirksamkeit von GcMAF peritoneale Mausmakrophagen zu aktivieren. Diese sollen nach Aktivierung Superoxid während der durch GcMAF ausgelösten Makrophagenaktivierungskaskade erzeugen.

Die spezifische Aktivität von alpha-NaGalases aus menschlichen Dickdarmtumorzelllinie HCT116, von menschlichen Hepatom-Zelllinien HepG2, und normalen menschlichen Leberzellen (Chang Leber-Zelllinie) wurde unter Verwendung von zwei Arten von Substraten bewertet; GalNAc-alpha-PNP (exo-Substrat) und Gal-beta-GalNAc-alpha-PNP (endo-Substrat).

Tumor-abgeleitete alpha-Nagalase wies eine höhere Aktivität als normale alpha-Nagalase auf, hatte eine höhere Substratspezifität gegenüber dem Exo-Typ-Substrat als dem endo-Substrat und behielt die Aktivität von pH7 bei.  GcMAF verbesserte die Superoxidproduktion der Mausmakrophagen, wobei die Vorbehandlung von GcMAF mit Tumorzelllysat die Aktivität verringert.

Wir schlussfolgern, dass Tumor-abgeleitete alpha-NaGalase sich in der biochemischen Charakterisierung im Vergleich zu normaler alpha-NaGalase aus normalen Chang Leberzellen unterscheidet. Zusätzlich verringert die von der Tumorzelle abgeleitete alpha-NaGalase die Aktivierungspotenz von GcMAF bezüglich der Makrophagen.

2002 Vorbereitung des vom Gc Protein-abgeleiteten Makrophagen-Aktivierungs-Faktor (GcMAF) und seiner Strukturcharakterisierung und biologischen Aktivität (PDF)

S Mohamad, H Nagasawa, Y Uto, H Hori.

Zusammenfassung. Hintergrund. Gc-Protein ist ein Vorläufer des Gc-Protein-abgeleiteten Makrophagen-Aktivierungsfaktors (GcMAF) in der durch Entzündungen ausgelösten Makrophagen-Aktivierungskaskade. Eine induzierbare beta-Galactosidase von B-Zellen und Neuraminidase von T-Zellen wandelt Gc-Protein zu GcMAF um.

Ergebnisse. Wir haben Gc-Protein erfolgreich aus humanem Serum gereinigt. GcMAF wurde durch Lektinblotting nachgewiesen und zeigte eine hohe biologische Aktivität.

Schlussfolgerung. Unsere Ergebnisse unterstützen die Bedeutung der terminalen N-Acetylgalactosamin-Einheit bei der GcMAF-vermittelten Makrophagen-Aktivierungskaskade und die Existenz von konstitutivem GcMAF in Humanserum. Diese vorläufigen Daten sind wichtig für die Konstruktion molekularen GcMAFs.

Andere veröffentlichte Forschungsarbeiten zu Gc-MAF

2011 Polymorphismus im Vitamin D-bindenden Protein als genetischer Risikofaktor bei der Pathogenese der Endometriose (PDF)

K Faserl, G. Golderer, L. Kremser, H. Lindner, B. Sarg, L. Wildt, B. Seeber.

Zusammenfassung. Frühere Studien zeigten eine mangelhafte entzündliche Reaktion bei Frauen, die eine Endometriose enwickeln. Die spezifischen immunologischen Defizite können bisher nicht vollständig erklärt werden.

Zielsetzung. Unser Ziel war es, Unterschiede in der Proteinexpression im Serum zu identifizieren, und damit die Pathophysiologie der Endometriose näher zu beleuchten.

Methode. Die Querschnittsstudie fand an einem Universitätsklinikum statt und untersuchte die Frauen, die sich zwischen 2003 und 2005 einer Laparoskopie unterzogen haben. Zu diesen Patienten gehörten Frauen im Alter von 18-49 Jahren, die sich einem chirurgischen Eingriff aufgrund von Schmerzen und / oder Unfruchtbarkeit oder elektiver Tubal Ligation unterzogen. Das Blut wurde präoperativ eingesammelt.

Hauptergebnis der Maßnahme. Die Proteomanalyse des Serums erfolgte mittels zweidimensionaler Differenzgelelektrophorese.

Ergebnisse. Wir fanden 25 Protein-Spots mit einem signifikanten Unterschied in der Fülle zwischen Frauen mit Endometriose und Kontrollpersonen, einschließlich Akute-Phasen-Proteine ​​und Ergänzungs-Komponenten. Die Anzahl an Vitamin D-bindendem Protein lag bei allen Endometriose-Pools um einen Faktor von etwa 3 gegenüber dem Kontroll-Pool höher. Die Analyse von spezifischen Allelprodukten unter Verwendung der nanoskaligen Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie zeigte, dass es das GC * 2-Allelprodukt war, das in Serum-Pools sowie in einzelnen Validierungsproben bei Frauen mit Endometriose stärker konzentriert war. Im Gegensatz zum GC * 1-Allelprodukt, das leicht in einen potenten Makrophagenfaktor (Gc-Protein-abgeleiteter Makrophagenaktivierungsfaktor) umgewandelt werden kann, liegt dies beim GC * 2-Allelprodukt praktisch nicht vor.

Schlussfolgerungen. Wir vermuten, dass die unzureichende Phagozytose-Funktion der Aktivierung von Makrophagen bei denen, die den GC * 2-Polymorphismus tragen (häufiger bei Endometriose), die Möglichkeit schafft endometriotische Gewebe in die Peritonealhöhle zu implantieren. Zukünftige Studien, die spezifische Vitamin-D-bindende Protein-Polymorphismen als Risikofaktoren für die Endometriose in größeren Populationen von Frauen bewerten, werden benötigt.

Kommentar des Autors:

Endometriose ist eine häufige Erkrankung von Frauen im fortpflanzungsfähigen Alter. Es betrifft etwa 10% aller Frauen und über 40% der Frauen mit Unfruchtbarkeit. Frauen mit Endometriose können eine Beeinträchtigung ihres Immunsystems und Störungen der Entzündungsreaktionen haben, so dass sich endometriotische Läsionen entwickeln.

Unsere beeindruckendste Entdeckung ist die der unterschiedlichen Häufigkeit eines spezifischen Allels von DBP, genauer des GC * 2 Allels. Die Expression des GC * 2-Allelprodukts war in allen Endometriosepools 3-fach höher als in der Kontrollgruppe.

DBP ist neben der Rolle als Transporter für Vitamin-D-Metaboliten der stärkste Aktivator für Makrophagen in Form des Gc-Protein-abgeleiteten Makrophagen-Aktivierungs-Faktors (GcMAF). Die GC * 1-Allelprodukte werden mit einer Gesamtrate von 10-30% glykosyliert, während das GC * 2-Allelprodukt mit einer Rate von 1-5% glykosyliert wird. Somit wird die Form des von dem GC * 1-Allel kodierten DBP viel leichter in GcMAF umgewandelt, wohingegen dies beim kodierten GC * 2-Allel kaum stattfindet.

Diejenigen Patientinnen mit nur GC * 2-Allelprodukten, sind überproportional in der Endometriosegruppe vertreten und besitzen eine stark verringerte Fähigkeit, DBP in GcMAF, den kritischen Makrophagenaktivator, umzuwandeln.

Basierend auf den Ergebnissen unserer Studie vermuten wir, dass der Immundefekt zumindest teilweise an der Unfähigkeit derer mit GC´2 Allelen liegt, die Phagozytose-Funktion der Makrophagen zu aktivieren.

Die Aktivierung von Makrophagen durch gezielte Immuntherapie bei betroffenen Frauen könnte die Grundlage einer neuen Behandlungsstrategie für Endometriose bilden.

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